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在RNA_seq数据的定量分析中，都是首先将reads比对到参考基因组，然后再使用定量软件进行定量，比如经典的hisat+stringTie的分析策略，对于单细胞转录组而言，其定量的原理也是一样的，只不过由于引入了UMI标签的设计，在定量时需要考虑相同UMI标签来自同一个转录本，直接使用传统的分析软件就不合适了。
官方提供的cell ranger软件不仅提供了数据拆分，也提供了定量等分析内容。
定量的前提都是需要将reads比对到参考基因组上，对于比对而言，第一步都是先对参考基因组建立索引，官网提供了人和小鼠的参考基因组供下载，网址如下
https://support./single-cell-gene-expression/software/downloads/latest
对于其他物种，我们只需要有基因组的fasta文件和转录本的gtf文件，就可以自定义参考基因组，步骤如下
1. 对GTF文件进行过滤
在原始的GTF文件中，会包含非常多类型的基因，可以通过mkgtf子命令，筛选其中感兴趣的基因，用法如下
-
cellranger mkgtf \
-
\
-
\
-
--attribute=gene_biotype:protein_coding
通过attribute属性来筛选，上述例子中只筛选出蛋白编码基因对应的记录。
2. 建立索引
通过mkref子命令来建索引，用法如下
-
cellranger mkref \
-
--genome=output_genome \
-
--nthreads=10 \
-
--fasta= \
-
--genes=
genome参数指定输出结果的目录，建好索引之后的目录结构如下
-
.
-
├── fasta
-
│ ├──
-
│ └──
-
├── genes
-
│ └──
-
├── pickle
-
│ └──
-
├──
-
└── star
可以看到，cell ranger对基因组建立了STAR的索引，然后通过STAR将reads比对到参考基因组上。
定量分析通过count子命令实现，用法如下
-
cellranger count \
-
--id=sample345 \
-
--transcriptome=database_path \
-
--fastqs=fastq_path \
-
--sample=mysample \
id参数指定输出目录的名字,transcriptome参数指定基因组索引所在目录，fastqs指定mkfastq命令产生的序列文件所在目录，sample参数指定需要分析的样本，在fastq_path下对应一个子目录。
count子命令不仅可以进行定量分析，还提供了聚类，PCA, tSNE等一系列分析结果，输出结果目的录下文件很多，在后续我们会详细解读该命令的输出结果。
·end·
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