项目文章 | 药学TOP期刊PR&ChIP-seq助力揭示激酶LIMK2促进梗死不良重构的机制

时间:2024-10-25 07:36:20

急性心肌梗死(MI)是全球死亡的主要原因,尽管MI的死亡率有所下降,缺血性心力衰竭的发病率却呈上升趋势。这一现象提示我们,尽管在急救和治疗急性心肌梗死方面取得了进展,但心脏在梗死后的长期功能恢复仍然是一个挑战。

2024年8月15日,南京鼓楼医院徐标教授团队、王涟教授团队在Pharmacological Research(IF:9.1)发表了题为“LIM kinase 2 activates cardiac fibroblasts and exacerbates postinfarction left ventricular remodeling via crosstalk between the canonical and non-canonical Wnt pathways”的研究论文。该研究表明,LIMK2通过增强磷酸化β-连环蛋白(Ser552)和Lrp6信号,促进心肌梗死后肌成纤维细胞增殖和不良心脏重塑。这提示LIMK2可能是心肌梗死后损伤治疗的一个靶点。爱基百客为该研究提供ChIP-seq技术支持

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研究路线

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研究结果

1. 小鼠心肌梗死后梗死边缘区LIMK核表达增加

LIMKs是细胞骨架动态的关键调节因子,但它们在心肌梗死(MI)中的参与尚未被研究。研究人员通过结扎左前降支冠状动脉评估了小鼠MI模型中LIMK1/2的表达。在小鼠心肌梗死(MI)模型中,LIMK1和LIMK2的表达水平在MI后逐渐增加(图1A-B),免疫荧光染色结果显示LIMK2在梗死边缘区域(BZ)的表达更为丰富(图1C-D),并且这种蛋白在细胞核中的积累在MI后增加(图1E-H)。此外,通过分析公共数据库中的转录组数据GSE183272(n=5),研究人员还发现RhoA信号通路及其下游的LIMK1和LIMK2在MI后上调,与纤维化相关基因的表达增加相一致,暗示LIMK2可能在MI后的病理重塑中扮演重要角色

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图1.MI后LIMKs表达增加

2. LIMK1/2的缺失减弱了心肌梗死后的病理心脏重构,并抑制了肌成纤维细胞的激活

采用LIMK1/2双敲除(DKO)小鼠制作心肌梗死模型,并在4周后与WT小鼠比较,评估心功能和病理重塑。心脏超声显示,与野生型(WT)小鼠相比,DKO小鼠在心肌梗死后展现出更好的心脏功能,包括提高的射血分数(EF%)和缩短分数(FS%),以及减小的左心室直径(LVIDd)和增厚的左心室壁(图2A-B)。此外,Masson染色发现DKO小鼠的心脏组织中纤维化程度降低(图2C-D),纤维化相关蛋白的表达量减少(图2E-F),且心肌纤维母细胞的激活标志物α-SMA和Periostin的表达也下调。在心肌梗死(MI)后,LIMK2及其磷酸化形式(phospho-LIMK2)与cFbs增殖标志物Ki-67和细胞外基质蛋白periostin的共定位增多(图2G-H),LIMK1及其磷酸化形式与periostin和Ki-67的共定位较少(图2I-J)。DKO MI小鼠产生的持续增殖的cFbs(Ki67+Postn+)少于WT MI组(图2K-L)。这些结果表明,LIMK2可能在心肌梗死后促进cFbs增殖中发挥作用

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图2.LIMKs的缺失减轻了心肌梗死后的病理性心脏重构,抑制了心肌cFbs的活化和增殖

3. 心肌成纤维细胞特异性LIMK2过表达通过增加肌成纤维细胞增殖促进不利的心脏重塑

研究人员利用腺相关病毒(AAV)作为载体,构建了携带LIMK1或LIMK2基因的AAV,以便在心脏成纤维细胞中特异性过表达LIMK1或LIMK2。处理4周后,评估所有小鼠的心功能,然后处死(图3A)。4组小鼠的生存曲线显示,WT+载药组死亡率高于DKO+载药组。与DKO+vehicle组相比,LIMK2OE组的死亡率要高得多,而LIMK1OE组的死亡率差异无统计学意义(图3B)。此外,心肌成纤维细胞LIMK2OE通过左心室增大(LVIDd)、左心室壁变薄(LVAWd、LVPWd)和收缩功能降低(EF%、FS%)显著加重心功能障碍。然而,DKO+vehicle组与DKO+LIMK1OE组之间没有差异(图3C-D)。Masson染色显示,LIMK2过表达显著增加心肌梗死后纤维化长度与心围之比和BZ胶原含量(图3E)。与上述结果一致,DKO+vehicle组 和DKO+LIMK1OE组α-SMA和骨膜蛋白水平均低于WT+vehicle组或DKO+LIMK2OE组(图3F)。此外,Postn和Ki-67免疫荧光共染色显示,DKO+LIMK2OE小鼠的增生性成纤维细胞(Postn+Ki-67+)多于DKO+vehicle组。DKO+LIMK1OE与DKO+vehicle组无差异,均维持低水平的成纤维细胞增殖(图3G-L)。综上所述,在心肌梗死后的促纤维化状态和纤维化中发挥重要作用的是LIMK2,而不是LIMK1

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图3.心肌成纤维细胞特异性LIMK2过表达通过促进肌成纤维细胞增殖促进不利的心脏重塑

4. 心肌梗死后,LIMK2依赖于其激酶活性来促进肌成纤维细胞的活化

鉴于LIMK2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,其功能是否依赖于其激酶活性尚不清楚。因此,对K360M突变产生显性LIMK2过表达的AAV进行进一步研究。与活性LIMK2相比,激酶非活性LIMK2(K360M)过表达不影响心肌梗死后DKO心脏增大(图4A)。与DKO+LIMK2OE小鼠相比,LIMK2K360MOE可改善心肌成纤维细胞的心脏收缩功能(EF%和FS%),降低左心室直径(LVIDd),增厚心室壁(LVAWd和LVPWd)。而DKO+vehicle组与DKO+LIMK2K360MOE组间无差异(图4B)。此外,与超声心动图结果一致,生存曲线显示LIMK2K360MOE小鼠的死亡率远低于LIMK2OE组,与DKO+vehicle 组相比无差异(图4C)。与功能性LIMK2相比,LIMK2K360MOE显著限制了过多的I型胶原沉积(图4D)。根据Postn和α-SMA,LIMK2K360MOE在DKO小鼠中的纤维化程度低于LIMK2OE(图4E)。此外,通过比较DKO+LIMK2OE组和DKO+LIMK2K360MOE组之间的Postn+Ki-67+比值,发现K360M突变的LIMK2在心肌梗死后促进肌成纤维细胞活化的功能减弱(图4F-G)。

为了进一步阐明LIMK2在肌成纤维细胞活化中的分子机制,研究者在DKO和野生型小鼠心脏中进行了深度MS-based定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。总蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的热图和PCA图显示,DKO小鼠心脏的主要成分与WT组有显著差异(图4H)。聚类分析结果发现189个和285个显著低磷酸化和高磷酸化蛋白,分别有274个下调位点和428个上调位点(图4I)。此外,26.09%的不同表达蛋白和52.13%的磷酸化差异蛋白位于细胞核内(图4J)。IPA功能表明,这些磷酸化水平改变的蛋白参与了各种病理过程,包括心脏扩张、心功能障碍和心脏纤维化(图4K)。这些发现强调了LIMK2激酶活性在心肌梗死后心脏重塑中的重要性,并为未来治疗策略提供了潜在的分子靶点。

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图4.心肌梗死(MI)后,LIMK2依赖激酶活性促进肌成纤维细胞活化

5. LIMK的缺失通过下调β-catenin Ser552位点的磷酸化和抑制β-catenin核易位来减少过度纤维化

根据蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据,研究了假手术小鼠和心肌梗死小鼠心脏核和细胞质组分中的磷酸化β-catenin(Ser552)和总β-catenin的含量。WT组心肌梗死后心肌细胞核磷酸化β-catenin(Ser552)和总β-catenin升高,可通过敲除LIMKs完全阻断。而细胞质中,phospho-β-catenin(Ser552)在WT MI中显著上调,在DKO MI小鼠中保持低水平(图5A)。WT梗死心脏显示β-catenin下游基因转录增加,LIMK1/2的缺失减少了ccnd1,cjun,mmp7的增加,并在转录物和蛋白质水平上保持不变(图5B-D)。免疫荧光染色鉴定了phospho-LIMK2和β-catenin的共定位(白色箭头)(图5E)。与心肌梗死后4周的DKO小鼠相比,WT小鼠的phospho-β-catenin和periostin明显升高(图5F)。这些结果证明,在病理条件下,LIMK缺失可以减少β-catenin易位,两者之间存在共定位

研究人员使用β-catenin激活剂CHIR-99021处理小鼠,以评估β-catenin激活对LIMK2敲除心脏保护作用的影响。结果显示,CHIR-99021增加了WT小鼠的死亡率和心脏功能障碍,而在DKO小鼠中,这种药物抵消了LIMK2缺失的保护作用,导致心脏功能下降和纤维化增加(图5G-J)。DKO小鼠在MI后心脏纤维化程度降低,而CHIR-99021处理则在一定程度上增加了纤维化(图5K,N)。CHIR-99021增加了WT和DKO梗死心脏细胞核中磷酸化β-catenin(Ser552)和总β-catenin,但对细胞质中磷酸化β-catenin的表达没有影响(图5M,P)。DKO组中,CHIR-99021的Wnt通路下游表达高于对照组(图5L,O)。这些结果表明,LIMK2可能通过调节β-catenin的核易位来促进心肌梗死后的病理性重塑

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图5.促进β-catenin核易位部分降低心肌梗死后LIMKs缺失的心脏保护作用

6. LIMK2结合并上调phospho-β-catenin Ser552的表达,促进TGF-β处理后新生小鼠心室成纤维细胞的活化和增殖

为了进一步探究LIMK2与β-catenin的关系,研究人员将小鼠成纤维细胞(cFbs)分为不同组别并给予TGF-β和CHIR-99021刺激。TGF-β作用后,仅WT cFbs细胞增殖率上调,DKO cFbs细胞增殖率无显著差异。然而,CHIR-99021刺激后,WT和DKO cFbs的增殖均得到促进,这表明β-catenin的核质转运在phospho-LIMK2调节成纤维细胞活化的机制中发挥了作用(图6C-D)。在TGF-β和TGF-β+CHIR-99021的刺激下,LIMK2和β-catenin的核易位都得到了促进。LIMKs的敲除阻断了这一转位,但可以通过CHIR-99021处理来抵消(图6A-B)。WB结果显示,TGF-β或TGF-β+CHIR-99021刺激后,细胞核中的β-catenin和phospho-β-catenin(Ser552)均升高(图6E-F)。在DKO cFbs中,无论是否给予TGF-β,核内的β-catenin和phospho-β-catenin都保持在较低水平。而给予CHIR-99021后,DKO cFbs核中的β-catenin表达上调。在细胞质中,六组间的β-catenin没有显著差异,但phospho-β-catenin在WT cFbs中经过TGF-β或TGF-β+CHIR-99021处理后增加了。β-catenin的下游基因在WT cFbs中经过TGF-β或TGF-β+CHIR-99021处理后增加了。尽管DKO cFbs持续表现出较低的lef、cmy、cjun和mmp7水平,但在CHIR-99021处理后可以逆转这些基因的表达(图6G-H)。

研究发现,在MI后,phospho-LIMK2与phospho-β-catenin(Ser552)在细胞核和细胞质中均增加,且两者在细胞核和细胞质中都存在相互作用,而在假手术小鼠心脏中,两者仅在细胞质中相互作用,表明它们可能在成核过程中具有协同功能(图6I-K)。此外,cFbs模型显示,在TGF-β刺激下,phospho-LIMK2与phospho-β-catenin(Ser552)之间的相互作用增强(图6L-M)。通过ZDOCK分析,发现LIMK2与β-catenin之间存在稳定的蛋白对接模型,其中Arg474与Tyr511之间存在阳离子-π相互作用,Phe341与Tyr511之间存在π堆叠作用(图6N)。这些结果强调了LIMK2在心肌纤维细胞反应中的重要作用,尤其是在TGF-β介导的纤维化过程中

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图6.LIMKs的缺失通过阻断β-catenin的核易位,减轻了TGF-β诱导的新生小鼠心室成纤维细胞的激活

7. 在肌成纤维细胞中,细胞核LIMK2的积累通过结合Lrp6启动子区来促进Wnt信号传导

为了研究LIMK2的功能,研究者生成了NLS缺失-LIMK2过表达(LIMK2ΔNLS OE)的AAV靶向肌成纤维细胞进行进一步研究(其中Postn作为启动子,删除了479-507aa)。与 vehicle AAV组相比,DKO心脏的心脏收缩功能(EF%, FS%)降低,心室壁(LVAWs)变薄。然而,与LIMK2 OE AAV相比,LIMK2ΔNLS OE小鼠有更好的心功能(EF%)和有限的心脏扩张(LVIDd)(图7A)。此外,LIMK2ΔNLS过表达对DKO心肌梗死(MI)小鼠的死亡率没有影响。在DKO+LIMK2ΔNLSOE组中,与DKO+LIMK2OE组和DKO+vehicle组相比,边界区(BZ)的胶原蛋白沉积水平介于两者之间,这与Col3a1、Col1a1、periostin和α-SMA的表达一致(图7B-C)。通过LIMK2、periostin和Ki-67的共染色评估,部分减少了肌成纤维细胞的激活。在DKO+LIMK2ΔNLSOE组中,细胞质LIMK2ΔNLS与periostin和Ki-67的共定位较少(图7D-E)。评估了LIMK2过表达对心肌纤维细胞中磷酸化β-catenin和总β-catenin在细胞核和细胞质中的表达影响,结果表明LIMK2促进了β-catenin的核易位和磷酸化水平的增加(图7F-I)。通过ChIP-seq技术发现LIMK2能够结合到Lrp6的启动子区域,从而可能增强Wnt信号通路的内部化(图7J)。LIMK基因的缺失降低了LRP6的表达,这种降低可以通过在成纤维细胞中过表达LIMK2来恢复。但在成纤维细胞特异性LIMK2ΔNLSOE的DKO小鼠心脏中,LRP6的表达没有变化(图7K-L)。上述结果进一步证实了LIMK2可能转移到细胞核中,并促进LRP6的转录,从而增强Wnt信号的内化

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图7.在肌成纤维细胞中,细胞核LIMK2的积累通过结合Lrp6启动子区来促进Wnt信号传导

文章总结

本文研究发现,LIMK2在心肌梗死后的心脏重塑中起着关键作用,通过促进β-catenin的磷酸化和核易位,激活Wnt信号通路,进而加剧心脏成纤维细胞的激活和纤维化。这些发现为心肌梗死后的心脏修复提供了新的治疗靶点。

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图 8.LIMK2促进梗死后不良重构

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