引物设计参数
红色的表示需要改
绿色的表示不需要改
箭头表示普通PCR
接下来，我们需要简单地为引物设计设定一些参数
1. 输入目的模板：
2. 引物位置和产物大小（qPCR可以设置跨越两端的外显子的长度，PCR也可以控制左右引物位置）
需要要求产物长度80--200bp，太短或者太长都不适合做荧光定量PCR检测，特别是荧光定量PCR的引物，要控制TM=60℃左右。
3. 是否跨越外显子区域
当我们设计原核生物(如细菌、病毒等)序列的引物时，我们在“Exon/intron selection”处直接选择“No preference”；
而当我们设计真核细胞中的mRNA的引物时，为了防止产物中有DNA污染，我们通常将引物设计在跨外显子处，在“Exon/intron selection”中选择“Primer must span an exon-exon junction ”。
4. 特异性（Specificitycheck）选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。（重要）
◆ 提供了 7 种数据库：RefSeq mRNA，Genome (reference assemblies from selected organisms)，RefSeqrepresentative genomes，RefSeq RNA(refseq_rna)，nr (the standard non-redundant database)，Genome (chromosomesfrom all organisms) 和 custom。
◆ 前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。
◆ 特别是，当你用 NCBI 的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST 可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。
同时，在下方高级参数设置处将引物的GC含量设置成40%-60%℃，最好45-55℃
最后，点击最下方的“Get Primers”，即可得到引物设计的结果。我们通常可以得到1条至多条引物，在界面上按分数高低从上至下排列
下一博客将会分享NCBI输出结果解读，以及PCR的引物验证