.8.26丨Nanopore甲基化测序产品概述

一、Nanopore甲基化
- 基本概念
  - 甲基化属于表观遗传
  - 遗传学：基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星（SSR）等
  - 表观遗传学：指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等
  - 表观遗传现象：DNA甲基化（去甲基化）、基因组印记、休眠转座子**、母体效应、基因沉默、核仁显性、RNA编辑等
  - 表观遗传学的常见机制
    - DNA 甲基化：化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现； l 组蛋白修饰
    - DNA去甲基化：组蛋白修饰：甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP 核糖基化
    - 染色质可接近性：经染色质重塑后呈现出松散的状态，被称为开放染色质或可接近性染色质（ATAC-Seq）
    - 非编码RNA调控
    - 蛋白-DNA互作
- DNA甲基化类型
  - 5-甲基胞嘧啶（5-mC）
    - 基本概念：甲基化C碱基在基因组上的分布包含三种形式（CG, CHG和 CHH，其中H代表A 或T或C碱基）
    - 特点
      - 植物甲基化多发生于CpG、CHG、CHH
      - 哺乳动物甲基化多发生于CpG二核苷酸序列上
      - CpG富集区域多位于基因的启动子区域
      - 位于启动子区域的甲基化一般会抑制转录
    - 作用方式
      - 抑制转录因子的结合，从而抑制转录过程
      - 结合抑制因子，从而抑制转录过程
    - 不同物种甲基化水平
      - 植物中，三种甲基化类型均存在
      - 动物以CpG为主
      - 甲基化具有一定保守性
  - N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）
    - 真核生物中，最常见的甲基化修饰是5-甲基胞嘧啶胞嘧啶（5mC）
    - 原核生物中，N6-甲基腺嘌呤（6mA，或m6A）是最普遍的DNA修饰
    - 真核生物表达丰度特别低，尤其是在哺乳动物，每百万个腺嘌呤中大概只有不到10个位点是6mA
    - 联川做得比较好
    - 特征分布
      - DNA 水平的6mA检测研究物种：莱茵衣藻、秀丽隐杆线虫、果蝇，蛙，小鼠、人、斑马鱼、猪和水稻等真核物种
      - 6mA位点富集在转录起始位点（TSS）,如莱茵衣藻
      - 基因组上广泛分布，如秀丽隐杆线虫，水稻
      - TSS位点6mA稀缺，如蛙和小鼠
      - 6mA在重复序列区富集，如果蝇，斑马鱼和小鼠 u 斑马鱼基因组的52.2%是重复序列，而其77%以上的6mA峰分布落在重复序列区
    - 生物学功能
      - 可能参与基因的转录
        莱茵衣藻，TSS附近富集6mA标记，且转录活性和甲基化状态呈现正相关
        
        果蝇中，DMAD介导的去6mA甲基，导致6mA附近的基因或者转座子表达受到抑制，6mA可能介导了基因或者转座子的活化表达
        
        小鼠的胚胎干细胞（mESC）中，6mA抑制了转座子和邻近基因的表达
        
        6mA与热胁迫关键基因的表达呈正相关
      - 可能参与核小体的定位
        莱茵衣藻中, 6mA通常位于核小体之间的linker DNA上，越远离TSS位点，6mA就变得越稀疏有可能是 6mA调节着核小体的定位
      - 可能作为一种表观Marker
        斑马鱼胚胎发育的早期，5mC处于去甲基化的状态，而6mA却处于丰度激增的状态, 此时的6mA可能作为一种补充性的表观marker，控制着基因的转录表达
      - 销售建议，将5-mC与6-mA一起做，进行联合分析，鉴定同一时期，不同甲基化的关系
  - *7-甲基鸟嘌呤（7-mG） (略)
  - m6A
    - 基本概念
      - RNA甲基化修饰占所有RNA修饰的60%以上，而m6A是高等生物mRNA和lncRNA上最为普通的修饰
      - 在RNA层面，哺乳动物的m6A修饰的比例为 0.1-0.4%，平均每条mRNA有3-5个m6A位点
      - 目前miRNA、circRNA、rRNA、tRNA和 snoRNA都可发生m6A修饰
    - 特点：
      - 主要存在于 DRACH 的基序上（D = A/G/U; R = A/G; H = A/C/U）
      - 出现位置存在富集现象：特别是在终止密码子周围、3\'非翻译区（3\'-UTR）和编码序列（CDS），少数出现在起始密码子附近，内含子很少
      - 人和小鼠 m6A 位置高度保守
    - 作用方式：
      - 5\'端甲基化修饰，主要功能为维持mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻译起始等
      - 3\'端 polyA修饰有助于出核转运、翻译起始及结合蛋白维持mRNA结构稳定
    - 技术手段：
      - 比色法
      - 液相色谱质谱联用（LC-MS）
      - MeRIP-seq：抗体富集，m6A高甲基化区域
      - miCLIP-seq：抗体富集，紫外交联，单碱基水平
- 销售建议：
  - DNA甲基化产品
    - 5mC
      - 传统：全基因组甲基化测序WGBS
      - 简化甲基化测序RRBS
      - 甲基化DNA免疫共沉淀测序MeDIP-Seq
    - 6mA
      - 传统：基于免疫沉淀法（6mA-IP）
      - 限制酶切法（6mA-RE-seq）
      - LC-MS/MS法三代单分子测序法（Pacbio）
    - 产品核心竞争力：ONT检测平台可以同时检测5mC与6mA
    - 缺陷：
      - 价格稍贵——甲基化客户一般经费充足
  - 除非有6mA研究经验，否则不建议向客户推荐。目前产品尚不清楚是否已研发完成
二、ONT甲基化平台
- 建库流程
  - 提取高质量基因组 DNA，利用Nanodrop、Qubit 和 0.35% 琼脂糖凝胶电泳进行纯度、浓度和完整性质检；
  - 利用gTube将基因组DNA打断成平均8kb左右；
  - 文库构建（官方试剂盒）：
    - DNA 损伤修复和末端修复，磁珠纯化；
    - 接头连接，磁珠纯化；
    - Qubit 文库定量。
  - 上机测序
- ONT甲基化分析流程
  - Guppy软件进行 basecall
  - Nanopolish 检测 CpG
  - tombo检测CHH (H=A/T/C)， CHG和6mA 位点
- ONT平台优势
  - 单碱基水平检测，无中间处理（重亚硫酸盐），不扩增（NGS测序）、不富集（抗体或酶切），真实还原碱基修饰信息
  - 测序读长长（8kb文库），避免短读长带来的拼接比对错误，鉴定准确 u 相同测序深度，鉴定到的甲基化位点数更多，一致性占比高（0.97以上）
  - 鉴定种类丰富（5mC & 6mA），多种碱基修饰一次搞定,数据具有可比性，性价比高（6mA市场价1W左右）
- 应用方向
  - 多组学联合
    - 植物上特有小RNA与DNA甲基化调控
  - 发育调控
    - DNA甲基化一般并不单独起转录调控作用，与其他组学共同调控；
    - DNA甲基化最稳定（不易变化）的调控方式；
    - 不能仅仅关注启动子区，不能仅仅关注单一组学
  - 胁迫
  - 其他（基因印记、基因沉默）
  - 疾病研究
- 生物学重复（3个）
- 环境应答与表现修饰
  - 鉴定表型后再取样
  - 行为学结果支持也可以测样
- 案例（略）
- 产品类型
  - 二代：WGBS 30X
  - 三代：Nanopore 30X
- 送样要求
  - DNA总量：
    - 单次建库2ug以上
    - 多次建库4.5ug以上
  - 纯度要求
    - a) OD260/280 在 1.7-2.2 之间；OD260/230 在 1.7-2.3 之间；
    - b) Nanodrop/Qubit 比值 0.8-2.5；检测峰图正常；
    - c) 澄清无色，无不可溶解物质；溶液中不含去污剂、表面活性剂、变性剂，螯合剂和高浓度的盐；
    - d) 无单链 DNA、 RNA、蛋白质或染料污染。
  - 长度要求
    - a) 平均片段大小： PFGE 或低浓度琼脂糖（0.3%）检测， >30kb；
    - b) 避免高速涡旋振荡等剧烈方式处理基因组 DNA，如需混匀，使用宽口径枪头轻柔吹洗或颠倒轻叩样本管；
    - c) 切忌反复冻融

秒客网

.8.26丨Nanopore甲基化测序产品概述

相关文章