MIT Molecular Biology 笔记6 转录的调控

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教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

转录的调控

原核生物的转录调控

一、转录调控原理

1、基因表达由调控蛋白控制

• 激活因子 activator
• 抑制因子 repressor

　　它们通常都是DNA结合蛋白

2、大多数的激活因子和抑制因子在转录起始水平发挥作用

　　①协同结合

• 本底水平basal level（组成型表达constitutive expression）
  • 聚合酶在偶然状态下自发结合启动子引起的表达
• 激活因子就是促进聚合酶和启动子的结合
• 激活因子的一个表面结合启动子附近DNA位点，另一表面结合聚合酶，将聚合酶募集（recruitment）至启动子附近
• E'coli就是这种方式
• 抑制因子结合与聚合酶重合的地方抑制转录（操纵子operator）

　　②变构

• 激活因子 刺激聚合酶 形成开放复合体 （glnA启动子中 NtC)
• 激活因子 引起 启动子DNA构象改变 开放复合体 (merT启动子中 MerR）
• 抑制因子 抑制逃离 （malT基因表达）

　　③远程激活

• 通过弯曲环化较远距离激活，或者阻碍激活

　　蛋白与DNA的特异性结合依赖helix-turn-helix与大沟的作用

　　协同结合和变构在调控中起到多种作用

• 信号的整合
• 特异信号控制调控因子

　　** 抗终止作用及其延续：基因调控不仅局限于转录起始调控

二、原核生物转录起始的调控

1、

• 激活因子 Cap（catabolic activator protein）
  • 是一种cAMP受体蛋白
• 抑制因子 Lac抑制因子
  • 结构性表达
• 葡萄糖缺乏时，Cap相应，结合上游位点
• 乳糖充足时， lac抑制因子没有活性

2、大概的机理

• Cap促进RNA聚合酶结合lac启动子
  • Cap招募聚合酶
  • lac基因缺乏-35 区，拥有UP-element
  • Cap二聚体的结合位点位于大约-60区（UP-element）
• Lac repress 抑制聚合酶结合
• Lac repress 占据了聚合酶的结合位点

lac启动子缺乏-35 区，拥有UP-element，这是激活因子控制的启动子的典型特征

3、Cap的结构：具有独立的激活表面和DNA结合表面

• CAP-αCTD-DNA形成三聚体才能激活转录

正控制 ：Positive control，PC

研究此问题时，一个CAP与RNA聚合酶接触的激活区氨基酸发生替换的突变体叫做正控制突变体

转录因子旁路实验证明了激活因子仅是协助聚合酶结合启动子

CAP与αCTD 被换
αCTD被换成DNA结合物（CAP）
增加聚合酶浓度

4、调控因子（包括CAP和Lac抑制因子） 以结构模体结合DNA

• 蛋白质以同源二聚体形式结合到反向重复序列位点上
• 每一个单体结合一个半位点
• 这一种结合依靠 helix-turn-helix识别特异DNA序列
• 一个α螺旋嵌入大沟
• 另一个α螺旋横跨大沟与主链相联系处
• 如此保证识别螺旋出现在正确位置，增加相互作用结合能

　　特殊地

• Lac 以四聚体的方式结合，出现环化
• helix-turn-helix 外区域也会与DNA互作
• 蛋白质可能导致DNA弯曲
  
  

5、Lac repress 与 CAP 的活性由信号触发的变构控制

• Lac repress
• 细胞本底表达lacZ编码的半乳糖苷酶
• 乳糖lactose进入细胞内 异构成别乳糖
• 别乳糖 使得 Lac repress 变构 失活
• CAP
• 葡萄糖glucose 减少， cAMP增多
• cAMP 与 CAP形成复合物， 变构，活化，结合DNA

6、组合控制： CAP也控制其他基因 ？？？？？？？？？？？？？？？

7、选择性的σ因子指导聚合酶选择性地结合启动子

• σ³²：
• 热刺激
• σ³²mRNA高效翻译
• 蛋白质瞬间稳定
• 启动相关保护基因的转录
• 噬菌体SPO1一系列选择性σ让基因有序表达

8、NtrC 直接刺激聚合酶 促使形成开放复合物

• 低氮 刺激 N突然C磷酸化
• NtrC暴露DNA结合域
• 结合到上游位点，并与σ54作用，启动转录
  • NtrC有ATPase活性，为开放复合体形成提供能量
• 需要IHF让DNA弯曲，这是一种远程激活

9、MerR使DNA链扭转 促使形成开放复合物

• 汞使MerR在DNA链背面结合
• 扭曲DNA
• 使得-10与-35区分布合理
  • merT的-10与-35元件相隔19bp而不是15-17，σ因子难以很好促进转录起始

10、有些抑制因子通过滞留聚合酶来抑制

• E.Coli的 gal抑制因子在没有半乳糖（galactose）的时候，与聚合酶相互作用，抑制向开放复合物的转变

11、AraC 与 CAP一起对araBAD操纵子的控制（双控制）

• AraC 通过与调控区不同的结合方式开进行开启和抑制
• 没有阿拉伯糖时，I₂位点没有结合，不能转录
• 此启动子也受CAP控制，最后，在拥有阿拉伯糖且缺乏葡萄糖时被启动

• araBAD启动子常被用作表达载体 expression vector

三、λ噬菌体的调控实例

1、λ噬菌体的生长和诱导

• 裂解生长 lytically
  • P_RM关闭；P_R，P_L开放
• 溶原生长 lysogenically
  • P_RM开放；P_R，P_L关闭

2、λ噬菌体的基因组

3.调控蛋白及结合位点

λ Repressor

• 与O_R1亲和力强
  • 通过协同结合，结合O_R1 O_R2
• λ repress 拥有抑制P_R启动子的能力
  • 占据聚合酶位点
• λ噬菌体可以激活P_RM启动子
  • 通过募集

Cro ，Control of repressor and other thing

• 与O_R3亲和力强
• 抑制P_RM启动子
• 占据位点

4、λ抑制因子 和 Cro 以不同模式结合控制溶原和裂解生长

• 起初 λ repressor 抑制Cro转录，促进cl转录
• cl转录产物正反馈于此作用
• λ repressor 太多会阻碍O_R3以负反馈
• 诱导后（噬菌体在危机环境逃离细胞）
• 表达的RecA切割 λ repressor，解除其作用
• Cro表达，抑制cl转录

抑制因子的负自我调控需要远程相互作用

O_R2-O_L2，O_R1-O_L1的八聚体作用，形成环化

这样方便了O_R3，O_L3被λ repressor的结合，

这样严格的控制了λ repressor的表达在一定的窗口内

• repressor过少 难以抑制裂解
• repressor过多，阻碍了向裂解的转化

5、λ cII 另一种控制溶原、裂解的因子

• 抑制因子的合成由一个启动子的转录来确立
• 接着由另一启动子维持

• PR，PL是强启动子，会结构性表达
• PRM是弱启动子，需要因子帮助

• 刚感染的噬菌体，PR，PL结构性表达
• 表达的cII 激活P_RE启动子
• 表达出cl 生成的 λ repressor 关闭 P_R，P_L启动子
• 溶原状态

E.Coli 的生长条件控制C II 的稳定性，控制裂解、溶原的选择

• 一群健康生长的细菌中，FtsH使得cll降解
• 进入裂解，感染更多细菌
• 生长环境恶劣，cll作用
  • 进入溶原，保持原有状态

6、转录抗终止作用（antitermination）

• λ噬菌体侵入细菌后，整合进入细菌染色体，并且利用细菌的启动子
• λ噬菌体的基因位于细菌基因终止子下游
• 利用转录抗终止作用来转录噬菌体蛋白

• 细菌的rRNA基因转录也有抗终止，以防止在发夹处终止（见genes XII 17.22）

7、逆向调控：RNA合成和稳定性控制相互影响并且决定基因表达

真核生物的转录调控

一、

• 真核生物的转录调控更为复杂，除了原核拥有的调控方式外，还有
• 核小体及其修饰物
• 更多的调控因子和更密集的调控序列
  • 转录系统结合位点：启动子
  • 调控因子单一结合区域：调控因子结合位点
  • 基因上包含所有调控因子结合位点的DNA片段：调控因子序列
  • 增强子enhancer和绝缘子insulator

二、从酵母到哺乳动物转录的保守机制

1、激活因子DNA结合与激活功能分离

• 酵母Gal4二聚体的结合域激活域相分离
• 与GAL1基因上游的四个UAS_G序列结合
• 域交换实验说明，结合域只要将激活域带到启动子，就能启动
  

双杂交实验

2、结合域：识别原理与细菌大致相同

• 有和细菌类似的同型二聚体

• 有的使用异二聚体，以增加可使用的范围
• 有的使用单体
• 一搬不改变DNA构相

①同型结构域蛋白质（homeodomain）

• 结构细节不同物种差异很大
  
• 右图
• 3为识别螺旋
• 1中伸出一臂，与小沟特异性结合

②含锌DNA结合域

• 锌原子与氨基酸残基作用，起到稳定作用
• 有些蛋白质有多个锌指结构，每个锌指以α螺旋嵌入大沟中，增加识别序列长度

③亮氨酸拉链结构

• 两个长的alpha螺旋形成钳形结构，将DNA夹于其中
• 每个α螺旋嵌入大沟一半的转折部分
• 二聚化由某一部位的疏水残基（如亮氨酸）疏水作用介导的
• 有亮氨酸拉链的蛋白质经常形成同型二聚体

④螺旋-环-螺旋蛋白

• 二聚体的每一个单体由大helix与小helix以非刚性的环分离
  
• 这两个环容许两结构靠近

⑤快速泳动蛋白

• 其高度保守肽链AT hooks与小沟作用
• 显著改变DNA构相

3、激活域的结构不确定性

• 激活域与靶点结合时会诱导成为螺旋结构
• 激活域由许多重复的具有弱小激活能力的小单元构成
• 缺乏整体上的结构
• 酸性特征模式
• 疏水残基
• p695

三、通过真核生物激活因子的募集结合基因的蛋白复合物

　　以募集为主，也有少数直接作用

• 募集核小体修饰成分，开启启动子
• 募集一般转录因子复合物（中介蛋白等）
• 募集刺激Pol II起始延伸的复合物（pTEFb/SEC）

1、激活因子募集转录装置到基因上

• 激活因子募集一个或多个复合体
• 其他没有募集的，则和以募集的结合，协同作用
• 大部分转录装置是在激活后才装载的

CHIP-Chip 和 CHIP-Seq是鉴别增强子的最佳方法

2、激活因子也募集核小体修饰物来帮助转录装置结合到启动子上

　　两种方式

• 增加组蛋白尾端化学基团（组蛋白乙酰转移酶）
  • 改变组蛋白末端与核小体的相互作用，松弛了染色质结构
  • 乙酰化的组蛋白易于与 TFIID 等的同源调节域(bromdomain)
    结合
• 替换\重塑 核小体（SWI/SNP）
  • 暴露核小体内部的结合位点

　　转录与特定的装置和修饰的关系

• 需要特定的组分和修饰
• 某些组分和修饰能提高效率
• 对组分和修饰的需求和特定环境有关

3、某些启动子上激活因子募集另一个因子来进行有效的起始和延伸

• 果蝇的热应激与转录抗终止：
• 转录在下游停滞
• 热应激：第二激活因子HSF募集P-TEF
• P-TEFb通过磷酸化CTD释放停滞的聚合酶
• 聚合酶暂停现象是普遍的：人的发育分化阶段

组蛋白修饰，转录延伸 和白血病

• 暂停和再激活有助于保持启动子少核小体并时刻准备快速诱导

4、远距作用：环与绝缘子

　　原理

• 一种模型: Chip蛋白与DNA相互作用，DNA形成许多小环，使启动子离增强子更近
• 绝缘子控制激活因子的行动，使得适当的启动子被激活（或沉默）
  • 绝缘子抑制染色质修饰的展开

5、某些基因群的正确表达需要位点控制区域（locus control region）

• 转录装置被募集到LCR
• 随着转录的前行，打开染色质
• 释放局部控制元件
• 这些单个启动子随后产生每个基因所需的高水平表达

四、信号整合与组合控制

1、激活因子协同作用促进信号整合

• 多个激活因子联合作用：协同作用
• 产生 1+1>2 的效果
• 协同的三个来源：
  • 多个激活因子各募集转录装置的同一组分
    • 中介蛋白的募集
  • 募集不同组分
  • 多个激活因子相互帮助与调控基因上游位点结合
    • 协作结合，如右图
    • 两个一起结合
    • 在第三者的帮助下结合
    • 第一个蛋白使染色质变构，促结合
• 协同使得多个激活因子存在时，基因才能表达

2、信号整合的例子

① HO因子受两个调控因子的控制，一个募集核小体修饰物，一个募集中介蛋白

• SWI5相距1kb，募集核小体修饰物
• SBF结合，募集中介蛋白

②激活因子因子协同作用，共同与人类干扰素β基因结合

• HMGA1拉直染色体
• 四种蛋白协同地一个挨一个结合
• 募集CBP：组蛋白修饰活性
• 募集转录装置

3、组合控制是真核细胞复杂性与多样性的核心所在

酿酒酵母S.cerevisiae交配型基因的组合控制

调控回路的可演化能力

乳酸酵母K.lactis 通过抑制RME消除对hsgs的激活

如此，把RME1插入到hsgs的调控回路中，增加了营养条件决定交配细胞类型的新的调控层次

五、转录抑制因子

• 核小体紧凑
• 组蛋白脱乙酰化
• 组蛋白尾部甲基化

• 竞争结合位点
• 抑制激活域
• 直接限制转录装置
• 通过（去）修饰来抑制

六、信号转导与转录调控因子的控制

1、信号的转导方式

• 示例：
• STAT和Ras通路
• 引导下游MAPK通路的Ras通路

2、信号控制真核细胞转录调控因子

• 激活区的暴露
  • 右图
• 控制运输入核
  • 与抑制性蛋白相互作用
  • 与细胞膜相互作用
  • 改变构象，使得入核信号隐藏

七、组蛋白与DNA修饰导致的基因沉默（silencing）

• 是一种位置效应
• 沉默在大段的基因序列上可以扩散
• 最常见的沉默形式是异染色质
  • 端粒
  • 着丝粒
• 修饰改变染色质密度
• 甲基化沉默
  • 抑制蛋白结合
  • 甲基化后易于被抑制因子识别

1、酵母中，沉默由组蛋白的脱乙酰化和甲基化介导

• Rap1募集 Sir 复合体至端粒
• Sir2使临近核小体脱乙酰化
• 未被乙酰化的尾部随后和Sir3，Sir4结合，募集更多Sir复合体
• 是DNA结合蛋白赋予了整个过程的特异性，在某些例子中，是RNA分子充当了这个角色

• 沉默区域扩散的节制：
  • 绝缘子元件阻碍组蛋白修饰的扩散
  • 其他种类的组蛋白修饰阻碍了Sir2的结合，终止了扩散
    • H3尾甲基化

组蛋白密码

• 特定的基因座上复杂的组蛋白修饰产生高度特异的信息

2、多梳通过调控组蛋白甲基化介导基因抑制

• PRC2与特异DNA结合蛋白形成Pho-RC抑制复合物，结合在DNA上
• PRC2的甲基转移酶活性，赖氨酸-27发生三甲基化
• PRC1的结合
• 核染色质压缩

3、哺乳动物细胞中DNA甲基化与沉默状态的基因相关 

• DNA甲基化
• DNA结合蛋白（MeCP2）识别
• DNA结合蛋白募集组蛋白脱乙酰酶，组蛋白甲基化酶

• 印迹（imprinting）
• 绝缘子元件的甲基化状态决定了CTCF能否结合，进而决定表达什么基因

八、基因的表观遗传调控

• 基因表达模式的继承：基因表达的某些状态通过细胞分裂得以继承，即使起始信号不再存在
• 与之相反的是有信号才表达的：lac、GAL

①抑制因子蛋白随细胞分裂而去到两个细胞，这些抑制因子蛋白足以刺激再合成补充

②维持甲基化酶对甲基化的维持

　　维持甲基化酶识别子代半甲基化位点，修饰

③核小体修饰理论

　　复制获得子代半甲基化的核小体，募集修饰蛋白，变成全甲基化

复习题（自己）：

• 在转录起始处发生的调控类型，并举例
• 调控蛋白如何识别DNA
• 选择性的σ因子选择性启动的实例和意义
• lac操纵子的机理与cap的结构
• 转录因子旁路实验
• 激活因子启动子的特征
• 噬菌体控制感染后裂解/溶原状态的选择，保持与转换的机理

• 与小沟作用的蛋白有哪些
  • TBP，LEF-1，高速泳动蛋白