今天来策下如何准确制备细胞周期测试的样品，真的是百试百灵哦！
简单介绍下实验原理
碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，可以与 DNA 和 RNA 结合，但其不能透过正常的细胞膜，所以对活细胞无染色作用。可通过冷乙醇或其他破膜剂的作用，使细胞膜通透性增加。
PI 进入细胞内后，选择性地与核酸结合，RNase 裂解 RNA 后，细胞内染料的荧光量与细胞核内的 DNA 含量成正比。
通过流式细胞仪检测单个细胞荧光强度得到相对 DNA 含量，根据各个时相 DNA 含量不同，将细胞分为不同的周期。
细胞周期实验流程图
具体操作流程及注意事项
1、将对数期的细胞接种于 6 孔板中(2×105 个 / 孔，根据细胞大小、增值速度适当调整)，每孔加 2 ml 培养基培养。
2、细胞贴壁后(根据细胞具体情况)，去除培养基，分别加入培养基配置的不同浓度药物 1 ml 孵育(不使用造成细胞大量死亡的药物浓度和孵育时间)。
3、药物作用结束后，收集培养液，1500 rpm，离心 4 min。一定要一并收集漂浮的死细胞，不然会严重影响结果。
4、消化收取贴壁细胞，吹打过程一应要轻柔充分，避免细胞受损、细胞黏连；离心转速为 2000 rpm，离心 4 min(离心转速不要超过 2000 rpm，也可以采用 1000 rpm，离心 5 min)，PBS 洗 3 遍，以去除培养基、药物残留及细胞碎片。合并培养液和贴壁细胞。
5、细胞沉淀中加入少量 PBS，轻柔充分重悬细胞。然后将重悬的细胞加入到 4℃预冷的 70％冰乙醇中固定，轻轻吹打均匀(切记！！！不要将冰乙醇加入到细胞中，这样会造成细胞黏连，严重影响结果)，封口膜封口，4℃过夜。
6、2000 rpm 离心 4 min，吸去固定液，PBS 洗两次，以去除固定液。
7、细胞中加入含 PI(50 μg/ml)、RNaseA(50 μg/ml，去除 RNA)和曲拉通(1％，通透细胞膜)的工作液 200 μl(曲拉通粘性大，配置时一定要涡旋，保证混合均匀)，室温避光孵育 30 min。按照步骤 1 中的铺板细胞数，这个体积的工作液可以保证测试时的细胞浓度正合适。
8、流式细胞仪检测细胞周期。染色后，可以使用 PBS 去除染液，也可选择不处理，亲测没有影响。
9、FlowJo 软件分析细胞周期时相分布。
注意！注意！！注意！！！
整个过程一定要尽量降低操作对细胞的损伤，要吹打轻柔，减少离心次数，转速不要超过 2000 rpm。
消化细胞时要保证细胞吹散，不要有细胞黏连，一旦这一步骤没有消化充分，后面很难再将细胞吹散，后果严重。
测试时细胞浓度一定要根据流式细胞仪的检测范围，不然可能会影响准确度。
今天就策到这里，下次告诉大家 FlowJo 软件分析细胞周期相分布时的注意事项，因为作者发现有 SCI 文章的流式周期分布图，明显是造假出来的，哈哈哈哈……
封面来源：站酷海洛 Plus
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