@HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1
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+HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1
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其中第一行以@开头,后面是reads的ID以及其他信息,例如上例中 HWUSI-EAS100R代表Illmina设备名称,6代表flowcell中的第六个lane,73代表第六个lane中的第73个tile,941:1973代表该read在该tile中的x:y坐标信息;#0,若为多样本的混合作为输入样本,则该标志代表样本的编号,用来区分个样本中的reads;/1代表paired end中的前一个read。
补充说明:Illmina测序仪一个flowcell中包含8个lane,每个lane可以测一个样本或多样本的混合物,其中一个lane包含2列,每一列又包含60个tile,每一个tile又会种下不同的cluster,如下图所示。
第二行为read的序列,不用多说!
紧接着下面两行代表该read的质量。
第三行以“+”开头,跟随者该read的名称(一般于@后面的内容相同),但有时可以省略,但“+”一定不能省。
第四行代表reads的质量。这一行可以详细说一下!Illumina测序仪是按照荧光信号来判断所测序的碱基是哪一种的,例如红黄蓝绿分别对应ATCG,那么一旦出现一个紫色的信号该怎么判断呢,因此对每个结果都有一个概率的问题。起初sanger中心用Phred quality score来衡量该read中每个碱基的质量,既-10lgP ,其中P代表该碱基被测序错误的概率,如果该碱基测序出错的概率为0.001,则Q应该为30,那么30+33=63,那么63对应的ASCii码为“?”,则在第四行中该碱基对应的质量代表值即为“?”,ASCii参考如下。
一般地,碱基质量从
0-40,既ASCii码为从 “!”(0+33)到“I”(40+33)。以上是sanger中心采用记录read测序质量的方法,Illumina起初没有完全依照sanger中心的方法来定义测序质量,而是把P换成了p/(1-p). 其他完全按照sanger的定义来做。但是他这形式在某些情况下是不准确的,可以看出当测序质量很高的情况下两种形式几乎没区别,但低质量的碱基则有区别了。
因此,Illumina有更换了好几种版本,从1.3版本升级到1.5版本再到1.8,最后完全采用sanger中的规则来做。因此,现在Illumina给出的测序质量值完全可以参考刚说的sanger方法。
测序流程:
library:样本DNA经过PCR扩增
lane:测序时的一条泳道,一个泳道可以只接受一个library的,也可以是多个library的,不同的library在两段是用不同的街头序列连起来作为标识的。当接受多个library的时候也是一起出的结果,当我们需要的测序深度不是特别深的时候就可以采用这种办法,根据不同的接头序列将这些数据分开成为一个个单独样本的fastq数据,这也是经常为什么在跑fastqc(质控)可以看到那些非正常的过表达序列。当然,一个library的DNA也可以用多个泳道测,这在需要很高的测序深度的时候才采用该策略。可以考虑在后续的比对生成的bam文件那里把他们合并起来成为一个bam文件。