Bowtie和Bowtie2使用
【怪毛匠子整理】
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Bowtie和Bowtie2使用
碱基 序列 种子 前导链 错配 基因组 末端
标题: Bowtie和Bowtie2使用
摘要: [Bowtie和Bowtie2使用]bowtie 比对http: bowtie-bio sourceforge net index shtmlhttp: www ncrna net bowtie-short-sequence-alignment-tool-detailed-solution http: www plob org 2011 12 13 932 html 常见的短序列比对工具有很多，如fasta、blast、bowtie、shrimp、s…… [关键词:碱基 序列 种子 前导链 错配 基因组 末端]……
关键词: 碱基 序列 种子 前导链 错配 基因组 末端
bowtie 比对
http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
http://www.ncrna.net/bowtie-short-sequence-alignment-tool-detailed-solution/
http://www.plob.org/2011/12/13/932.html
常见的短序列比对工具有很多，如fasta、blast、bowtie、shrimp、soap等。每个工具都有其自身的优点，但同时也具备了一些缺点。权衡利弊，我选择bowtie作为主要的短序列比对工具。它速度很快，比对结果也容易理解。
现在举个例子来探讨bowtie的使用方法：现在有GENOME.fa、高通量测序数据Reads.fa，我们希望将Reads.fa比对到基因组GENOME.fa上。
（一）、对Reference文件(GENOME.fa)建库
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1 |
bowtie-build GENOME.fa GENOME.fa $ bowtie2-build genome.fasta index |
建库步骤可能需要1h甚至几个小时，建议在后台执行：
nohup bowtie-build GENOME.fa GENOME.fa &
（二）、将Reads.fa比对到GENOME.fa上，只能比对到正链，且匹配到基因组不多于20个不同位置，允许有1个错配
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1 |
bowtie -f -a -m 20 -v 1 --al Reads_aligned --un Reads_unaligned --norc GENOME.fa Reads.fa Reads.bwt 2> log $ bowtie2 -u 10000 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam |
- 注：
- -f 指定query文件为fasta格式
- -a 保留所有比对结果
- -m 指定最大比对到基因组的次数
- -v 允许最大错配数，为[0-2]
- --al 能map到GENOME的reads，fasta格式
- --un 不能map到GENOME的reads，fasta格式
- --norc 不输出匹配到负链的结果；如果不想输出比对到正链的结果，则用"--nofw"。不指定该选项则正负链结果都输出
- 后面依次写上GENOME索引文件，Reads文件，输出结果文件Reads.bwt，日志文件log。
（三）、bowtie输出结果的说明
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1 2 |
sample001_x75 + Chr1 12453 ATCGGCCAATTACGGACTTAA IIIIIIIIIIIIIIIIIIIII 4 9:G>T 1 2 3 4 5 6 7 8 |
- 1. query id
- 2. "+"表示正向match；"-"表示对query作反向互补后match
- 3. reference id
- 4. 第2列为"+"时，表示query 第一个碱基map到reference(5"->3")上的位置，0-based(以0开始)；第2列为"-"时，表示query的反向互补序列第 一 个碱基map到reference(5"->3")上的位置，0-based(以0开始)
- 5. 如果第2列为"+"，则和query序列一致；否则，和query序列反向互补
- 6. 质量文件，如果query文件为fasta格式，则无法获取质量文件，用I代替，I的数量与query序列长度一致
- 7. 当前query能map到GENOME的4个不同位置
- 8. 如果存在第8列，表示有mismatch。第8列可以分为三个部分，最左端的数字，中间的碱基为reference碱基，最右端的碱基为query碱基，下面分情况讨论：
- 第2列为"+"时：最左端的数字9表示query从5"端数起，第10个碱基为"T"，而对应的reference为"G";
第2列为"-"时：最左端的数字9表示query先作反向互补，然后从3"端数起，第10个碱基为"T"，而对应的reference为"G";
Bowtie2使用方法与参数详细介绍
http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
http://www.hzaumycology.com/chenlianfu_blog/?p=178
http://www.plob.org/2012/09/02/4540.html
懒人必看
Bowtie2 -q --phred33 --sensitive --end-to-end -I 0 -X 500 --fr --un unpaired --al aligned \ --un-conc unconc --al-conc alconc -p 6 --reorder -x{-1-2| -U} -S []
用法：
bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]
必须参数：
-x <bt2-idx> 由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀。首先 在当前目录搜寻，然后 在环境变量 BOWTIE2_INDEXES 中制定的文件夹中搜寻。 -1 <m1> 双末端测寻对应的文件1。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和 -2 <m2> 中制定的文件一一对应。比如:"-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB _2.fq". 测序文件中的reads的长度可以不一样。 -2 <m2> 双末端测寻对应的文件2. -U <r> 非双末端测寻对应的文件。可以为多个文件，并用逗号分开。测序文件中的reads的 长度可以不一样。 -S <hit> 所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出。
以下是可选项：
输入
-q 输入的文件为FASTQ格式文件，此项为默认值。 -qseq 输入的文件为QSEQ格式文件。 -f 输入的文件为FASTA格式文件。选择此项时，表示--ignore-quals也被选择了。 -r 输入的文件中，每一行代表一条序列，没有序列名和测序质量等。选择此项时，表示-- ignore-quals也被选择了。 -c 后直接为比对的reads序列，而不是包含序列的文件名。序列间用逗号隔开。选择此项时， 表示—ignore-quals也被选择了。 -s/--skip <int> input的reads中，跳过前<int>个reads或者pairs。 -u/--qupto <int> 只比对前<int>个reads或者pairs（在跳过前<int>个reads或者 pairs后）。Default: no limit. -5/--trim5 <int> 剪掉5"端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0). -3/--trim3 <int> 剪掉3"端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0). --phred33 输入的碱基质量等于ASCII码值加上33. 在最近的illumina pipiline中 得以运用。 --phred64 输入的碱基质量等于ASCII码值加上64. --solexa-quals 将Solexa的碱基质量转换为Phred。在老的GA Pipeline版本中得以 运用。Default: off. --int-quals 输入文件中的碱基质量为用“ ”分隔的数值，而不是ASCII码。比如 40 40 30 40...。Default: off.
–end-to-end模式
--very-fast Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 --fast Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50 --sensitive Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15 (default in --end-to-end mode) --very-sensitive Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
–loca模式下的预设参数
–loca模式下的预设参数 --very-fast-local Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00 --fast-local Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75 --sensitive-local Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75 (default in --local mode) --very-sensitive-local Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
参数：
-N <int> 进行种子比对时允许的mismatch数. 可以设为0或者1. Default: 0. -L <int> 设定种子的长度. ************************************************************ 功能选项 给bowtie的一些参数设定值的时候，使用一个计算公式代替，于是值的大小与比对序列的长 度成一定关系。<func>有三部分组成: (a)计算方法, 包括常数(C),线性(L),平方根(S)和 自然对数(G); (b)一个常数; (c)一个系数. 例如: <func> 为 L,-0.4,-0.6 则计算公式为: f(x) = -0.4 + -0.6 * x <func> 为G,1,5.4 则计算公式为: f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x) ************************************************************ -i <func> 设定两个相邻种子间所间距的碱基数。 ************************************************************ 例如：如果read的长度为30, 种子的长度为10, 相邻种子的间距为6,则提取出的种子如下 所示： Read: TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAAC Seed 1 fw: TAGCTACGCT Seed 1 rc: AGCGTAGCTA Seed 2 fw: CGCTCTACGC Seed 2 rc: GCGTAGAGCG Seed 3 fw: ACGCTATCAT Seed 3 rc: ATGATAGCGT Seed 4 fw: TCATGCATAA Seed 4 rc: TTATGCATGA ************************************************************ 在--end-to-end模式中默认值为”-i S,1,1.15”.即表示f(x) = 1 + 1.15 * sqrt(x). 如果read长度为100, 则相邻种子的间距为12. --n-ceil <func> 设定read中允许含有不确定碱基(非GTAC,通常为N)的最大数目. Default: L,0,0.15. 计算公式为: f(x) = 0 + 0.15 * x, 表示长度为100的read 最多运行存在15个不确定碱基. 一旦不确定碱基数超过15, 则该条read会被过滤掉. --dpad <int> Default: 15. --gbar <int> 在read头尾<int>个碱基内不允许gap. Default: 4. --ignore-quals 计算错配罚分的时候不考虑碱基质量. 当输入序列的模式为-f, -r 或 者-c的时候, 该设置自动成为默认设置. --nofw/--norc –nofw设定read不和前导链(forward reference strand)进行比对; --norc设定不和后随链(reverse-complement reference strand)进行比对. Default: both strands enabled. --end-to-end 比对是将整个read和参考序列进行比对. 该模式--ma的值为0. 该模式为 默认模式, --local模式冲突. --local 该模式下对read进行局部比对, 从而, read两端的一些碱基不比对，从而使比 对得分满足要求. 该模式下 –ma默认为2.
得分罚分参数
--ma <int> 设定匹配得分. --local模式下每个read上碱基和参考序列上碱基匹配, 则 加<int>分. 在—end-to-end模式中无效. Default: 2. --mp MX,MN 设定错配罚分. 其中MX为所罚最高分, MN为所罚最低分. 默认设置下罚分与 碱基质量相关. 罚分遵循的公式为: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) ). 其中Q为碱基的质量值. 如果设置了—ignore-qual参数, 则错配总是罚最高分. Default: MX = 6, MN = 2. --np <int> 当匹配位点中read, reference上有不确定碱基(比如N)时所设定的罚分值. Default: 1. --rdg <int1>,<int2> 设置在read上打开gap 罚分<int1>, 延长gap罚分<int2>. Default: 5, 3. --rfg <int1>,<int2> 设置在reference上打开gap 罚分<int1>, 延长gap罚分 <int2>. Default: 5, 3. --score-min <func> 设定成为有效比对的最小分值. 在—end-to-end模式下默认值为: L,-0.6,-0.6; 在--local模式下默认值为: G,20,8.
报告参数
-k <int> 默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果, 并报告其中最好的 比对结果(如果好几个最好的比对结果得分一致, 则随机挑选出其中一个). 而在该模式下, bowtie2最多搜索出一个read <int>个比对结果, 并将这些结果按得分降序报告出来. -a 和-k参数一样, 不过不限制搜索的结果数目. 并将所有的比对结果都按降序报告出来. 此参数和-k参数冲突. 值得注意的是: 如果基因组含有很多重复序列时, 该参数会导致程序 运行极其缓慢.
Effort 参数
-D <int> 比对时, 将一个种子延长后得到比对结果, 如果不产生更好的或次好的比对结果, 则该次比对失败. 当失败次数连续达到<int>次后, 则该条read比对结束. Bowtie2才会 继续进行下去. Default: 15. 当具有-k或-a参数, 则该参数所产生的限制会自动调整. -R <int> 如果一个read所生成的种子在参考序列上匹配位点过多. 当每个种子平均匹配超 过300个位置, 则通过一个不同的偏移来重新生成种子进行比对. <int>则是重新生成种子 的次数. Default: 2.
Paired-end 参数
-I/--minins <int> 设定最小的插入片段长度. Default: 0. -X/--maxins <int> 设定最长的插入片段长度. Default: 500. --fr/--rf/--ff 设定上下游reads和前导链paired-end比对的方向. --fr: 匹配时， read1在5"端上游, 和前导链一致, read2在3"下游, 和前导链反向互补. 或者read2在 上游, read1在下游反向互补; --rf: read1在5"端上游, 和前导链反向互补, read2在 3"端下游, 和前导链一致; --fr: 两条reads都和前导链一致. Default: --fr. 默认 设置适合于Illumina的paired-end测序数据; 若是mate-paired, 则要选择—rf参数. --no-mixed 默认设置下, 一对reads不能成对比对到参考序列上, 则单独对每个read进 行比对. 该选项则阻止此行为. --no-discordant 默认设置下, 一对reads不能和谐比对(concordant alignment, 即满足-I, -X, --fr/--rf/--ff的条件)到参考序列上, 则搜寻其不和谐比对(discon cordant alignment, 即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上, 但是不满足-I, -X,--fr/--rf/--ff的条件). 该选项阻止此行为. --dovetail read1和read2的关系为dovetail的时候,该状况算为和谐比对. 默认情况 下dovetail不算和谐比对. --no-contain read1和read2的关系为包含的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情况 下包含关系算为和谐比对. --no-overlap read1和read2的关系为有重叠的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情 况下两个reads重叠算为和谐比对.
输出参数
-t/--time --un <path> 将unpaired reads写入到<path>. --un-gz <path> 将unpaired reads写入到<path>, gzip压缩. --un-bz2 <path> 将unpaired reads写入到<path>, bz2压缩. --al <path> 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入<path>. --al-gz <path> ... ,gzip压缩. --al-bz2 <path> ... ,bz2压缩. --un-conc <path> 将不能和谐比对的paired-end reads写入<path>. --un-conc-gz <path> ... ,gzip压缩. --un-conc-bz2 <path> ... ,bz2压缩. --al-conc <path> 将至少能和谐比对一次以上的paired-end reads写入<path>. --al-conc-gz <path> ... ,gzip压缩. --al-conc-bz2 <path>... ,bz2压缩. --quiet 安静模式,除了比对错误和一些严重的错误, 不在屏幕上输出任何东西. --met-file <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入文件<path>. 用于debug. Default: metrics disabled. --met-stderr <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入标准错误文件句柄. 和上 一个选项不冲突. Default: metrics disabled. --met <int> 每隔<int>秒写入一次metrics记录. Default: 1.
Sam 参数
--no-unal 不记录没比对上的reads. --no-hd 不记录SAM header lines (以@开头). --no-sq 不记录@SQ的SAM header lines. --rg-id <text> 设定read group Id到<text>. --rg <text> 增加<text>作为一行@RG.
性能参数
-o/--offrate <int> 无视index的offrate值, 以<int>取代之. Index默认的<int> 值为5. <int>值必须大于index的offrate值, 同时<int>越大, 耗时越长，耗内存越少. -p/--threads NTHREADS 设置线程数. Default: 1 --reorder 多线程运算时, 比对结果在顺序上会和文件中reads的顺序不一致, 使用该选 项, 则使其一致. --mm 使用内存定位的I/O来载入index, 而不是常规的文件I/O. 从而使多个bowtie程 序共用内存中同样的index, 节约内存消耗.
其它参数：
--qc-filter 滤除QSEQ fileter filed为非0的reads. 仅当有—qseq选项时有效.
Default: off.
--seed <int> 使用<int>作为随机数产生的种子. Default: 0.
--version 打印程序版本并退出
-h/--help 打印用法信息并推出
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Bowtie2使用指南 |
常用步骤
- 对参考序列构建index
$ bowtie2-build genome.fasta index
- 尝试使用前10000个reads进行比对
$ bowtie2 -u 10000 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam
使用8个线程进行比对
$ bowtie2 -p 8 -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam
比对的sam结果中添加了read group信息
$ bowtie2 -p 8 --rg-id sample01 --rg "PL:ILLUMINA" --rg "SM:sample01" -x index -1 reads1.fq -2 reads2.fq -S out.sam
常用的参数进行比对，可以更改其中的参数获得更好的结果
$ bowtie2 -q --phred33 --sensitive --end-to-end -I 0 -X 500 --fr --un unpaired --al aligned --un-conc unconc --al-conc alconc -p 6 --reorder -x <bt2-idx> {-1 <m1gt; -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]
用法：
bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]
bowtie2-build用法
bowtie2-build默认情况下将fasta文件换成index的数据库。
$ bowtie2-build <fasta文件> <要生存的索引文件前缀名>
必须参数：
-x <bt2-idx>由bowtie2-build所生成的索引文件的前缀。首先 在当前目录搜寻，然后
在环境变量BOWTIE2_INDEXES中制定的文件夹中搜寻。
-1 <m1>双末端测寻对应的文件1。可以为多个文件，并用逗号分开；多个文件必须和-2
<m2>中制定的文件一一对应。比如:"-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq -2 flyA_2.fq,flyB
_2.fq".测序文件中的reads的长度可以不一样。
-2 <m2>双末端测寻对应的文件2.
-U <r>非双末端测寻对应的文件。可以为多个文件，并用逗号分开。测序文件中的reads的
长度可以不一样。
-S <hit>所生成的SAM格式的文件前缀。默认是输入到标准输出。
以下是可选参数：
输入参数
-q输入的文件为FASTQ格式文件，此项为默认值。
-qseq输入的文件为QSEQ格式文件。
-f输入的文件为FASTA格式文件。选择此项时，表示--ignore-quals也被选择了。
-r输入的文件中，每一行代表一条序列，没有序列名和测序质量等。选择此项时，表示--
ignore-quals也被选择了。
-c后直接为比对的reads序列，而不是包含序列的文件名。序列间用逗号隔开。选择此项时，
表示—ignore-quals也被选择了。
-s/--skip <int> input的reads中，跳过前<int>个reads或者pairs。
-u/--qupto <int>只比对前<int>个reads或者pairs（在跳过前<int>个reads或者
pairs后）。Default: no limit.
-5/--trim5 <int>剪掉5'端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0).
-3/--trim3 <int>剪掉3'端<int>长度的碱基，再用于比对。(default: 0).
--phred33输入的碱基质量等于ASCII码值加上33.在最近的illumina pipiline中
得以运用。最低碱基质量是“#”。
--phred64输入的碱基质量等于ASCII码值加上64.最低碱基质量是“B”。
--solexa-quals将Solexa的碱基质量转换为Phred。在老的GA Pipeline版本中得以
运用。Default: off.
--int-quals输入文件中的碱基质量为用“ ”分隔的数值，而不是ASCII码。比如40 40
30 40...。Default: off.
–end-to-end模式下的预设参数
--very-fast Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
--fast Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
--sensitive Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.15 (default in --end-to-endmode)
--very-sensitive Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
–loca模式下的预设参数
--very-fast-local Same as: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00
--fast-local Same as: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75
--sensitive-local Same as: -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75 (default in --local mode)
--very-sensitive-local Same as: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
比对参数：
-N <int>进行种子比对时允许的mismatch数.可以设为0或者1.Default: 0.
-L <int>设定种子的长度.
************************************************************
功能选项
给bowtie的一些参数设定值的时候，使用一个计算公式代替，于是值的大小与比对序列的长
度成一定关系。<func>有三部分组成: (a)计算方法,包括常数(C),线性(L),平方根(S)和
自然对数(G); (b)一个常数; (c)一个系数.
例如:
<func>为L,-0.4,-0.6则计算公式为: f(x) = -0.4 + -0.6 * x
<func> 为G,1,5.4则计算公式为: f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)
************************************************************
-i <func>设定两个相邻种子间所间距的碱基数。
************************************************************
例如：如果read的长度为30,种子的长度为10,相邻种子的间距为6,则提取出的种子如下
所示：
Read: TAGCTACGCTCTACGCTATCATGCATAAAC
Seed 1 fw: TAGCTACGCT
Seed 1 rc: AGCGTAGCTA
Seed 2 fw: CGCTCTACGC
Seed 2 rc: GCGTAGAGCG
Seed 3 fw: ACGCTATCAT
Seed 3 rc: ATGATAGCGT
Seed 4 fw: TCATGCATAA
Seed 4 rc: TTATGCATGA
************************************************************
在--end-to-end模式中默认值为”-i S,1,1.15”.即表示f(x) = 1 + 1.15 *
sqrt(x).如果read长度为100,则相邻种子的间距为12.
--n-ceil <func>设定read中允许含有不确定碱基(非GTFAC,通常为N)的最大数目.
Default: L,0,0.15.计算公式为: f(x) = 0 + 0.15 * x,表示长度为100的read
最多运行存在15个不确定碱基.一旦不确定碱基数超过15,则该条read会被过滤掉.
--dpad <int> Default: 15.
--gbar <int>在read头尾<int>个碱基内不允许gap. Default: 4.
--ignore-quals计算错配罚分的时候不考虑碱基质量.当输入序列的模式为-f, -r或
者-c的时候,该设置自动成为默认设置.
--nofw/--norc –nofw设定read不和前导链(forward reference strand)进行比对;
--norc设定不和后随链(reverse-complement reference strand)进行比对.
Default: both strands enabled.
--end-to-end比对是将整个read和参考序列进行比对.该模式--ma的值为0.该模式为
默认模式, --local模式冲突.
--local该模式下对read进行局部比对,从而, read两端的一些碱基不比对，从而使比
对得分满足要求.该模式下 –ma默认为2.
得分罚分参数
--ma <int>设定匹配得分. --local模式下每个read上碱基和参考序列上碱基匹配,则
加<int>分.在—end-to-end模式中无效. Default: 2.
--mp MX,MN设定错配罚分.其中MX为所罚最高分, MN为所罚最低分.默认设置下罚分与
碱基质量相关.罚分遵循的公式为: MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) ).
其中Q为碱基的质量值.如果设置了—ignore-qual参数,则错配总是罚最高分. Default:
MX = 6, MN = 2.
--np <int>当匹配位点中read, reference上有不确定碱基(比如N)时所设定的罚分值.
Default: 1.
--rdg <int1>,<int2>设置在read上打开gap罚分<int1>,延长gap罚分<int2>.
Default: 5, 3.
--rfg <int1>,<int2>设置在reference上打开gap罚分<int1>,延长gap罚分
<int2>. Default: 5, 3.
--score-min <func>设定成为有效比对的最小分值.在—end-to-end模式下默认值为:
L,-0.6,-0.6;在--local模式下默认值为: G,20,8.
报告参数
-k <int>默认设置下, bowtie2搜索出了一个read不同的比对结果,并报告其中最好的
比对结果(如果好几个最好的比对结果得分一致,则随机挑选出其中一个).而在该模式下,
bowtie2最多搜索出一个read <int>个比对结果,并将这些结果按得分降序报告出来.
-a和-k参数一样,不过不限制搜索的结果数目.并将所有的比对结果都按降序报告出来.
此参数和-k参数冲突.值得注意的是:如果基因组含有很多重复序列时,该参数会导致程序
运行极其缓慢.
Effort 参数
-D <int>比对时,将一个种子延长后得到比对结果,如果不产生更好的或次好的比对结果,
则该次比对失败.当失败次数连续达到<int>次后,则该条read比对结束. Bowtie2才会
继续进行下去. Default: 15.当具有-k或-a参数,则该参数所产生的限制会自动调整.
-R <int>如果一个read所生成的种子在参考序列上匹配位点过多.当每个种子平均匹配超
过300个位置,则通过一个不同的偏移来重新生成种子进行比对. <int>则是重新生成种子
的次数. Default: 2.
Paired-end 参数
-I/--minins <int> 设定最小的插入片段长度. Default: 0.
-X/--maxins <int> 设定最长的插入片段长度. Default: 500.
--fr/--rf/--ff 设定上下游reads和前导链paired-end比对的方向. --fr: 匹配时，
read1在5'端上游, 和前导链一致, read2在3'下游, 和前导链反向互补. 或者read2在
上游, read1在下游反向互补; --rf: read1在5'端上游, 和前导链反向互补, read2在
3'端下游, 和前导链一致; --ff: 两条reads都和前导链一致. Default: --fr. 默认
设置适合于Illumina的paired-end测序数据; 若是mate-paired, 则要选择—rf参数.
--no-mixed 默认设置下, 一对reads不能成对比对到参考序列上, 则单独对每个read进
行比对. 该选项则阻止此行为.
--no-discordant 默认设置下, 一对reads不能和谐比对(concordant alignment,
即满足-I, -X, --fr/--rf/--ff的条件)到参考序列上, 则搜寻其不和谐比对(discon
cordant alignment, 即两条reads都能独一无二地比对到参考序列上, 但是不满足-I,
-X,--fr/--rf/--ff的条件). 该选项阻止此行为.
--dovetail read1和read2的关系为dovetail的时候,该状况算为和谐比对. 默认情况
下dovetail不算和谐比对.
--no-contain read1和read2的关系为包含的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情况
下包含关系算为和谐比对.
--no-overlap read1和read2的关系为有重叠的时候, 该状况不算为和谐比对. 默认情
况下两个reads重叠算为和谐比对.
输出参数
-t/--time --un <path> 将unpaired reads写入到<path>.
--un-gz <path> 将unpaired reads写入到<path>, gzip压缩.
--un-bz2 <path> 将unpaired reads写入到<path>, bz2压缩.
--al <path> 将至少能比对1次以上的unpaired reads写入<path>.
--al-gz <path> ... ,gzip压缩.
--al-bz2 <path> ... ,bz2压缩.
--un-conc <path> 将不能和谐比对的paired-end reads写入<path>.
--un-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.
--un-conc-bz2 <path> ... ,bz2压缩.
--al-conc <path> 将至少能和谐比对一次以上的paired-end reads写入<path>.
--al-conc-gz <path> ... ,gzip压缩.
--al-conc-bz2 <path>... ,bz2压缩.
--quiet 安静模式,除了比对错误和一些严重的错误, 不在屏幕上输出任何东西.
--met-file <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入文件<path>. 用于debug.
Default: metrics disabled.
--met-stderr <path> 将bowtie2的检测信息(metrics)写入标准错误文件句柄. 和上
一个选项不冲突. Default: metrics disabled.
--met <int> 每隔<int>秒写入一次metrics记录. Default: 1.
Sam 参数
--no-unal不记录没比对上的reads.
--no-hd不记录SAM header lines (以@开头).
--no-sq不记录@SQ的SAM header lines.
--rg-id <text>设定read group ID为text。在SAM文件的头中增加一行@RG，在输出的SAM
文件中添加Tag "RG:Z:text"。
--rg <text>使用text作为@RG的一列，比如"SM:Pool1"。在@RG中加入多列，则多次使用
该参数即可。在进行Variant calling的过程中需要@RG头，SM信息和Tag RG。
性能参数
-o/--offrate <int> 无视index的offrate值, 以<int>取代之. Index默认的<int>
值为5. <int>值必须大于index的offrate值, 同时<int>越大, 耗时越长，耗内存越少.
-p/--threads NTHREADS 设置线程数. Default: 1
--reorder 多线程运算时, 比对结果在顺序上会和文件中reads的顺序不一致, 使用该选
项, 则使其一致.
--mm 使用内存定位的I/O来载入index, 而不是常规的文件I/O. 从而使多个bowtie程
序共用内存中同样的index, 节约内存消耗.
其它参数：
--qc-filter 滤除QSEQ fileter filed为非0的reads. 仅当有—qseq选项时有效.
Default: off.
--seed <int>使用<int>作为随机数产生的种子. Default: 0.
--version打印程序版本并退出
-h/--help 打印用法信息并推出
bowtie2是一款速度快，占用内存少的一款将段序列片段定位到参照序列上的一款软件。以下的内容基本上是对bowtie2的英文manual的翻译，并截取了其中比较中药的部分。
bowtie2与bowtie1的区别：
bowtie2并不是bowtie1的简单的升级版，与bowtie1有较大的区别:
· 由于近年来HTS的发展，产出的序列长度比之前更长一些。bowtie2在处理长度大于50bp的数据是速度更快；
· bowtie2支持gap形式的比对；
· bowtie2有local alignment和end-to-end alignment两个模式的比对，而bowtie1只有end-to-end 模式的比对；
· bowtie2对输入的序列的长度没有要求，而bowtie1最长要求为1000nt;
获得并安装bowtie2:
从download中下载，选择适合自己操作系统的版本。现有的bowtie2基本上支持所有的操作系统。在linux等操作系统下安装之后可以添加环境变量，一边方便之后的使用。
bowtie2对匹配质量的评价：
1.Socres：越高则相似度越大
score值是根据序列和参考序列的相似程度决定的，决定该值大小的因素有很多：选择的匹配的模式，序列的长度，错配以及是否存在gap，罚分设置等。罚分的设置可以通过--ma (匹配奖励), --mp (错配罚分), --np (出现N时罚分), --rdg (序列中出现gap的罚分) and --rfg (参照序列中出现gap的罚分) 。
· end-to-end alignment 模式：
出现一个错配默认罚6分，出现一个2nt的gap默认罚11分(默认gap open罚 5分，gap延长1nt罚3分)。
· local aligment模式：
出现一个错配默认罚6分，出现一个2nt的gap默认罚11分(默认gap open罚 5分，gap延长1nt罚3分)。假如配对成功的话，奖励默认2分。
2.Mapping qulity：越高则位点越独特
bowtie2有时并不能完全确定一个短的序列来自与参考序列的那个位置，特别是对于那些比较简单的序列。但是bowtie2会给出一个值来显示出这个段序列来自某个位点的概率值，这个值就是mapping qulity。Mapping qulity的计算方法是：Q=-10log10p，Q是一个非负值，p是这个序列不来自这个位点的估计值。
假如说一条序列在某个参考序列上找到了两个位点，但是其中一个位点的Q明显大于另一个位点的Q值，这条序列来源于前一个位点的可能性就比较大。Q值的差距越大，这独特性越高。
Q值的计算方法来自与SAM标准格式，请查看SAM总结。
3.Aliging pair
bowtie2支持paired-end或者是mate-pair形式的测序结果，具体在运行参数中设置 –1 指定第一个文件，-2 指定第二个文件就行。
报告
报告的模式决定了bowtie2寻找多少个位置的匹配，并报告这些匹配。Bowtie2有三种不同的报告模式。
1. 默认模式：寻找多个位点，并报告出最好的那一个
在默认情况下，bowtie2寻找明确的，序列的位点。当它找到一个确认的结果的时候，它将会继续寻找比这个结果更好的结果，或者至少一样好的结果。当bowtie2已经超过了寻找努力(通过-D 和 -R设置)，或者它已经找到了所有的结果的时候，bowtie2将停止查找。
2. -k模式
在-k模式下，bowtie2最多寻找N(N为-k 的参数)个独特的位点。例如N为2，那么bowtie2就寻找最多2个位点，就结束查找，并报告出两个位点的结果。
3. -a模式
在-a模式下，bowtie2将会将查找所有可能的匹配位点，并报告出所有的结果。这样就可能会导致程序运行速度很慢。
命令行
1. 函数参数
在bowtie2中有些参数是通过函数来指定的，而非使用特定的数值或者设置来指定。这些函数需要用户指定三个参数来确定该函数：（1）函数类型 F,（2）一个常数 B，（3）一个系数 A。函数类型包括：常数型 C，线性型 L，平方根型 S，和自然对数型 G。这些参数被指定为 F,B,A，分别为函数类型，常量，和系数。例如：L,-0.4,-0.6就定义了一个函数：
f(x)=-0.4+-0.6x
2. 使用
bowtie2运行的参数一般为：
bowtie2 [options]* -x <bt2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} -S [<hit>]
3. 主要参数
· -x<bt2-idx> 为已经建立好的参考序列的索引文件，通过bowtie2_build建立；
· -1 <m1> 由逗号分隔的包含mate 1的多个文件，也可以输入一个文件；
· -2 <m2> 由逗号分隔的包含mate 2的多个文件，也可以只有一个文件；
· -U <r> 由逗号分隔的包含不是pair reads的文件；
· -S <hit> 结果输出的位置。
4. 设置
输入设置:
-q 输入的序列为FASTQ格式
–qseq 输入的序列为QSEQ格式
-f 输入的序列为FASTA格式
-r 输入的序列为每行一条序列，并不包含其他的信息
-c 从命令行输入序列
-s <int> 忽略输入序列中的前<int>条序列
-u <int> 只保留输入序列中的前<int>条序列
-5 <int> 剪切掉5`端的<int>个碱基
-3 <int> 剪切掉3`端的<int>个碱基
end-to-end模式下的预设值的选项
–very-fast 即: -D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
–fast 即： -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50
–sensitive 即： -D 15 -R 2 -L 22 -i S,1,1.1（为end-to-end模式下的默认设置）
--very-sensitive 即： -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
local 模式下的预设选项
–very-fast-local 即: -D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00
–fast-local 即: -D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75
–sensitive-local 即: -D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75 (为 --local 模式下的默认设置)
–very-sensitive-local 即: -D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50
比对的设置
-N <int> 设置在种子配对是允许的错配数
-L <int> 设置种子的长度
--local bowite2进行local模式的匹配
--end-to-end bowtie2进行end-to-end模式匹配
还有几个参数这里就不介绍了
打分设置
--ma <int> 配对成功奖励
--mp MX,MN 设置当出现错配的时候最大的(MX)和最小的(MN)罚分，被扣的分数为MN+floor((mx-mn)(MIN)(Q,40)/40),Q为phred quality 值。
--np <int> 设置出现N的时候的罚分
--rfg <int1>,<int2> 设置gap open(<int1>)和延伸(<int2>)的罚分
报告设置
-k <int> 之前已经介绍过
-a 之前已经介绍过
输出设置
输出设置比较简单就不写了
性能设置
-p 设置线程数目
SAM 输出
一下是一个简单的对bowtie2输出的SAM格式文件的说明，更加详细的SAM格式文件说明请参考SAM format specification。
在SAM输出的结果中每一行都包括十二项通过Tab分隔，从左到右分别是：
1 序列的名字；
2 概括出一个合适的标记，各个数字分别代表
· 1 序列是一对序列中的一个
· 2 比对结果是一个pair-end比对的末端
· 4 没有找到位点
· 8 这个序列是pair中的一个但是没有找到位点
· 16 在这个比对上的位点，序列与参考序列反向互补
· 32 这个序列在pair-end中的的mate序列与参考序列反响互补
· 64 序列是 mate 1
· 128 序列是 mate 2
假如说标记为以上列举出的数目，就可以直接推断出匹配的情况。假如说标记不是以上列举出的数字，比如说83=（64+16+2+1），就是这几种情况值和。
3 参考序列的名字
4 在参考序列上的位置
5 mapping qulity
6 代表比对结果的CIGAR字符串，如37M1D2M1I，这段字符的意思是37个匹配，1个参考序列上的删除，2个匹配，1个参考序列上的插入。M代表的是alignment match(可以是错配)
7 mate 序列所在参考序列的名称
8 mate 序列在参考序列上的位置
9 估计出的片段的长度，当mate 序列位于本序列上游时该值为负值。
10 read的序列
11 ASCII码格式的序列质量
12 可选的区域
· AS:i 匹配的得分
· XS:i 第二好的匹配的得分
· YS:i mate 序列匹配的得分
· XN:i 在参考序列上模糊碱基的个数
· XM:i 错配的个数
· XO:i gap open的个数
· XG:i gap 延伸的个数
· NM:i 经过编辑的序列
· YF:i 说明为什么这个序列被过滤的字符串
· YT:Z
· MD:Z 代表序列和参考序列错配的字符串
bowtie2-build
在运行bowtie2之前，需要先建立参考序列的索引文件。bowtie2-build 输出六个文件分别是 .1.bt2,.2.bt2, .3.bt2, .4.bt2, .rev.1.bt2, 和.rev.2.bt2。
bowtie2-build运行的命令为：
bowtie2-build [options]* <reference_in> <bt2_base>
<reference_in> 参考序列的文件
<bt2_base> 要输出的索引文件的名称，运行bowtie2的时候使用这个名称
选项
-f 输入参考序列为fasta格式
-c 通过命令行输入参考序列
其余参数不再介绍