一、bwa比对软件的使用
1、对参考基因组构建索引
bwa index -a bwtsw hg19.fa # -a 参数：is[默认] or bwtsw，即bwa构建索引的两种算法，两种算法都是基于BWT的（BWT search while the CIGAR string by Smith-Waterman alignment.）。-a bwtsw对于短的参考序列是不工作的，必须要大于等于10Mb；-a is 不适用于大的参考序列，必须要小于等于2G；
output：hg19.fa.amb、hg19.fa.ann、hg19.fa.bwt、hg19.fa.pac和hg19.fa.sa
2、寻找输入reads文件的SA坐标
对于pair end数据，每个reads文件单独做运算，single end数据就不用说了，只有一个文件。
pair end：
bwa aln hg19.fa read1.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read1.fq.gz.sai or bwa aln hg19.fa read1.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I -f read1.fq.gz.sai
bwa aln hg19.fa read2.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read2.fq.gz.sai or bwa aln hg19.fa read2.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I -f read2.fq.gz.sai
single end：
bwa aln hg19.fa read.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read.fq.gz.sai or bwa aln hg19.fa read.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I -f read.fq.gz.sai
主要参数说明：
-o int：允许出现的最大gap数。
-e int：每个gap允许的最大长度。
-d int：不允许在3’端出现大于多少bp的deletion。
-i int：不允许在reads两端出现大于多少bp的indel。
-l int：Read前多少个碱基作为seed，如果设置的seed大于read长度，将无法继续，最好设置在25-35，与-k 2 配合使用。
-k int：在seed中的最大编辑距离，使用默认2，与-l配合使用。
-t int：要使用的线程数。
-R int：此参数只应用于pair end中，当没有出现大于此值的最佳比对结果时，将会降低标准再次进行比对。增加这个值可以提高配对比对的准确率，但是同时会消耗更长的时间，默认是32。
-I int：表示输入的文件格式为Illumina 1.3+数据格式。
-B int：设置标记序列。从5’端开始多少个碱基作为标记序列，当-B为正值时，在比对之前会将每个read的标记序列剪切，并将此标记序列表示在BC SAM 标签里，对于pair end数据，两端的标记序列会被连接。
-b ：指定输入格式为bam格式。bwa aln hg19.fa read.bam > read.fq.gz.sai
3、生成sam格式的比对文件
如果一条read比对到多个位置，会随机选择一种
single end：bwa samse hg19.fa read.fq.gz.sai read.fq.gz > read.fq.gz.sam
参数：
-n int：如果reads比对次数超过多少次，就不在XA标签显示。
-r str：定义头文件。‘@RG\tID:foo\tSM:bar’，如果在此步骤不进行头文件定义，在GATK后续分析中还是需要重新增加头文件。
pair end：bwa sampe -a 500 read1.fq.gz.sai read2.fq.gz.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam
参数：
-a int：最大插入片段大小。
-o int：pair end两reads中其中之一所允许配对的最大次数，超过该次数，将被视为single end。降低这个参数，可以加快运算速度，对于少于30bp的read，建议降低-o值。
-r str：定义头文件。同single end。
-n int：每对reads输出到结果中的最多比对数。
4、其他
（1）
bwa mem ref.fa reads.fq > aln-se.sam 单端测序
bwa mem ref.fa read1.fq read2.fq > aln-pe.sam 双端测序
（2）
bwa aln ref.fa short_read.fq > aln_sa.sai
bwa samse ref.fa aln_sa.sai short_read.fq > aln-se.sam
bwa sampe ref.fa aln_sa1.sai aln_sa2.sai read1.fq read2.fq > aln-pe.sam
（3）
bwa bwasw ref.fa long_read.fq > aln.sam
二、sam文件格式说明
1、
XT:A:U/R Type:Unique/Repeat/N/Mate-sw # U指第五列比对值>0;R指第五列比对值==0
参考文献：
1、《GATK使用方法详解（包含bwa使用）》http://www.tanboyu.com/gatk-bwa.html
2、《bwa英文操作手册》http://www.chinadmd.com/file/ecaeoaecwzvs3trpxpwtzows_1.html
